Producción de biomasa y caracterización química de Lentinula edodes cultivado en biorreactor bajo diferentes condiciones

La ingeniería bioquímica juega un papel importante en el desarrollo tecnológico de los procesos de obtención ya sea de cuerpos fructíferos de setas con potencial medicinal para el consumo directo, o en la fabricación de nutracéuticos y/o suplementos dietarios. Esta investigación implementó una metodología en biorreactor para el cultivo del hongo macromiceto Lentinula edodes, conocido comúnmente como Shiitake, con el objetivo de evaluar el efecto que tienen la velocidad de agitación y el flujo de aire en la producción de biomasa y de metabolitos de mediana y baja polaridad. Se determinó que el rendimiento y la productividad más altos de producción de biomasa se logra a unas condiciones de 80 rpm y 0,50 vvm obteniendo 0,0260 g/g y 0,00433 g/L*h respectivamente. Igualmente, en cuanto a la composición de esta biomasa, se concluyó que se genera un máximo contenido de proteína (33,4% del micelio liofilizado) a unas condiciones de 140 rpm y 0,75 vvm, los esteroles alcanzaron un porcentaje de 89,32% del extracto en DCM a 80 rpm y 0,5 vvm. Los resultados del análisis por GC-MS confirman la amplia variedad de compuestos que se pueden obtener a partir de un cultivo en biorreactor del hongo Lentinula edodes.

Biochemical engineering plays an important role in the technological development of the processes for obtaining either mushroom fruiting bodies with medicinal potential for direct consumption, or in the manufacture of nutraceuticals and/or dietary supplements. This research implemented a methodology in a bioreactor for the cultivation of the Lentinula edodes macromycete fungus, commonly known as Shiitake, with the aim of evaluating the effect of agitation speed and air flow on the production of biomass and metabolites of median and low polarity. Thus, it was found that the highest yield and productivity of biomass production is achieved at conditions of 80 rpm and 0,50 vvm, obtaining 0,0260 g/g and 0,00433 g/L*h respectively. Likewise, in the study of the content of metabolites it was concluded that for the protein 33,4% of the lyophilized mycelium was reached at conditions of 140 rpm and 0,75 vvm, the sterols reached a percentage of 89,32% of the extract. in DCM at 80 rpm and 0,5 vvm. The results of the GC-MS analysis confirm the wide variety of compounds that can be obtained from a bioreactor culture of the Lentinula edodes fungus.

Condiciones para el análisis de proteínas del micelio de Lentinuia edodes obtenido por fermentación en estado líquido / Conditions for protein analysis of Lentinuia edodes mycelium obtained from liquid state fermentation / Condições para a análise de proteínas do micélio de Lentinuia edodes obtidas por fermentação em estado líquido

Resumen Pocos son los trabajos enfocados en la producción biotecnológica y el desarrollo de herramientas analíticas en torno a la Lentinuia edodes, seta comestible con potencial para el desarrollo de nutracéuticos. Por esto, en esta investigación, se estudió la producción de biomasa del hongo en el tiempo, mediante fermentación en estado líquido, y se seleccionaron las condiciones que permitieron la obtención de extractos para la aplicación de herramientas para análisis proteómico. Los métodos de extracción de proteínas, ácido tricloroacético (TCA) - acetona y TCA - acetona - fenol, fueron comparados en términos del rendimiento de extracción y los perfiles de separación usando electroforesis en 1D (SDS-PAGE) y 2D (IEF-SDS PAGE). Se determinó que a los 10 días de crecimiento se obtiene la mayor producción de biomasa y proteína total. La extracción con TCA - acetona - fenol presentó un mayor rendimiento, resolución y número de bandas en la electroforesis 1D. En 2DE, los dos métodos permitieron la extracción de proteínas con puntos isoeléctricos en el rango de pH 3-10, pero el método TCA - acetona - fenol conllevó a una extracción diferencial, favoreciendo el rango de masa de 33 a 113 kDa. Estos resultados se constituyen en una primera aplicación de técnicas de separación electroforética para futuros estudios proteómicos.

Abstract Few are the investigations focused on the biotechnological production and the development of analytical tools about Lentinuia edodes, an edible mushroom which has a potential for being used in the development of nutraceutical products. For this reason, in this research, the production of biomass of the mushroom over time by liquid state fermentation (LSF) was studied. Then, the conditions that allow obtaining protein extracts for the application of tools for proteomic analysis were selected. Trichloroacetic acid (TCA) - acetone and TCA - acetone - phenol were the two protein extraction methods which were compared in terms of extraction yield and separation profiles in 1D (SDS-PAGE) and 2D (IEF-SDS PAGE) electrophoresis. The highest production of biomass and total protein content was obtained after 10 days of LSF. Protein extraction with TCA - acetone -phenol presented the highest yield, resolution and number of bands in 1D electrophoresis. In 2DE the two methods allowed the extraction of proteins with isoelectric points in pH 3-10 range but, the TCA - acetone - phenol method favored a differential extraction of proteins in the range of 33 to 113 kDa. These results constitute a first application of electrophoretic separation techniques for future proteomic studies.

Resumo Lentinuia edodes é um cogumelo comestível com potencial para o desenvolvimento de nutracêuticos. Entretanto, os trabalhos voltados para a produção biotecnológica e o desenvolvimento de ferramentas analíticas que permitem aprofundar sua composição são incipientes. Nesta pesquisa, a produção de biomassa do fungo ao longo do tempo por meio de fermentação no estado líquido foi estudada e as condições que permitem obter extratos para a aplicação de ferramentas para análise proteômica foram selecionadas. Os métodos de extração de proteínas usados foram ácido tricloroacético (TCA) - acetona e TCA - acetona - fenol e comparada em termos de rendimento de extracção e perfis de separação utilizando electroforese 1D (SDS-PAGE) e 2D (IEF-SDS PAGE). Foi determinado que após 10 dias de crescimento, a maior produção de biomassa e proteína total foi obtida. A extração com TCA - acetona - fenol apresentou maior rendimento, maior resolução e número de bandas em eletroforese 1D. No 2DE os dois métodos permitiram a extração de proteínas com pontos isoelétricos na faixa de pH 3-10, mas o método TCA - acetona - fenol levou a uma extração diferencial, favorecendo a faixa de 33 a 113 kDa. Estes resultados constituem uma primeira aplicação de técnicas de separação eletroforética para futuros estudos proteômicos.

Estudio comparativo de la producción de biomasa en fermentación superficial y en estado líquido de macromicetos con diferentes fuentes nutrimentales / Comparative study of the production of biomass in surface fermentation and in the liquid state of macromycetes with different nutrient sources

RESUMEN Los macromicetos han adquirido gran interés por su importancia alimenticia, terapéutica y económica, razón por la cual es necesario enfocar esfuerzos en la búsqueda de optimizar su producción de biomasa. El presente trabajo buscó determinar y comparar el efecto de la fermentación líquida (FEL) y superficial (FeSup) (medio solido) sobre la producción de biomasa de Flammulina velutipes, Hypsizigus tessulatus y Grifola frondosa empleando seis fuentes de nutrientes de bajo costo: harina de soja, trigo integral, maíz blanco, maíz amarillo precocido, salvado de trigo y semillas de linaza molida. Los resultados de la FeSup permitieron determinar que la especie de mayor crecimiento radial, indistintamente de la fuente de nutrientes, es F. velutipes seguida de H. tessulatus y por ultimo G. frondosa. Adicionalmente, la mayor producción de biomasa con FeSup se observa para F. velutipes y H. tessulatus (6,4480 g/L y 5,7320 g/L, respectivamente) Por el contrario, para la FEL, G. frondosa (11,4620 g/L) es la especie de mayor producción. La comparación en la producción de biomasa empleando FEL y FeSup, evidenció que los resultados son dependientes de la técnica de cultivo y que la FeSup no puede ser empleada para la selección preliminar de hongos macromicetos, enfocada en la producción de biomasa por FEL.

ABSTRACT Macromycetes have acquired great interest because of their nutritional, therapeutic and economic importance, which is why it is necessary to focus efforts in the search to optimize their biomass production. The present work sought to determine and compare the effect of liquid fermentation (FEL) and surface fermentation (FeSup) (solid medium) on the biomass production of Flammulina velutipes, Hypsizigus tessulatus and Grifola frondosa using six sources of low cost nutrients: soybeans, whole wheat, white corn, precooked yellow corn, wheat bran and ground flax seed. The results of the FeSup allowed to determine that the species with the highest radial growth, indistinctly from the nutrient source, is F. velutipes followed by H. tessulatus and finally G. frondosa. Additionally, the highest biomass production with FeSup is observed for F. velutipes and H. tessulatus (6.4480 g/L and 5.7320 g/L, respectively) On the contrary, for the FEL, G. frondosa (11.4620 g/L) is the species with the highest production. The comparison in the production of biomass using FEL and FeSup, showed that the results are dependent on the culture technique and that the FeSup cannot be used for the preliminary selection of fungi macromycetes, focused on the production of biomass by FEL.

Evaluation of a method using high performance liquid chromatography with ultraviolet detection for the determination of statins in macromycetes of the genus Pleurotus cultivated by fermentation processes.

The applicability of high-performance liquid chromatography with ultraviolet light (HPLC-UV) for the determination of the presence of statins in macromycetes of the genus Pleurotus was analyzed. The fungi were obtained by liquid-state fermentation (LSF) using unconventional sources of carbon as substrates and solid-state fermentation (SSF) employing agro industrial wastes. Five statins were used as standards: lovastatin and simvastatin in the lactone form (LOVL and SIML), their corresponding hydro-acidic forms (LOVH and SIMH) and pravastatin (PRA). The following measures were evaluated: the linearity, accuracy and precision, detection limit (DL) and quantification limit (QL). The results demonstrated HPLC-UV to be an effective tool for detecting the presence of statins in extracts of LSF and SSF products. Likewise, it was hypothesized that the strains that were used for the study do not produce statins. This finding highlights the importance of continuing to evaluate other strains of the same genus by using techniques such as HPLC to first separate sufficient quantities of the compounds that were detected using the standard technique but that did not match the retention time (tR) of any of the standards used.

Las estatinas: Actividad biologica y produccion biotecnologica / Statins: Biological activity and biotechnological production

Las estatinas de tipo I son metabolitos f¨²ngicos de gran inter¨¦s no s¨®lo por su efecto hipocolesterolemiante sino por el n¨²mero de efectos pleiotr¨®picos que presentan. El papel de las estatinas en la reducci¨®n de l¨ªpidos en la sangre est¨¢ ampliamente documentado. En la actualidad, los estudios cl¨ªnicos han puesto en evidencia que las estatinas impactan positivamente en varios ¨®rganos y en diferentes estados de algunas enfermedades, independientemente de la reducci¨®n en los niveles de colesterol. Exhiben efecto antiinflamatorio, antioxidante y acci¨®n inmunomoduladora, lo que les confiere potencial impacto terap¨¦utico en el tratamiento de varias enfermedades. Estudios recientes las posicionan como antirretrovirales, impidiendo la replicaci¨®n del virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH). El hecho de que generan pro-apoptosis, inhibici¨®n en el crecimiento y respuesta a favor de la diferenciaci¨®n de las c¨¦lulas neopl¨¢sicas de diversos or¨ªgenes, las hace ¨²tiles en el tratamiento de leucemia, c¨¢ncer de mama, c¨¢ncer colo-rectal, de pulm¨®n, de pr¨®stata y de p¨¢ncreas. No se deben dejar de lado los efectos ben¨¦ficos sobre el metabolismo ¨®seo, gracias a su asociaci¨®n con el aumento en la densidad mineral ¨®sea y el efecto protector contra el Alzheimer y otros tipos de demencia, posiblemente debido a su participaci¨®n en la relaci¨®n entre el ¦Â-amiloide y los niveles de colesterol.

Statins of type I are fungic metabollites of great importance not only by its hypocholestorolemic but also by its number pleoitropic effects that they show. The role of statins in the reduction of lipids in the blood is broadly reported. Currently, clinic surveys have put into evidence that statins both impact in a positive manner on several organs and in different stages of some diseases, regardless of the cholesterol reduction levels. They show an anti-inflammatory effect, anti-oxidant, and immune modulator action, which give them a therapeutic potential in the treatment of several diseases. Recent studies place them as anti-retrovirus avoiding the replication of the human immunodeficiency virus (HIV). The fact that they generate pro-apoptosis, inhibition on growing, and an favorable effect of the neo-plastic cell differentiation of diverse origins make them useful in the leukemia treatment, breast-cancer, colorectal, lung cancer, prostate cancer, and pancreas cancer. The beneficial side effects on bone metabolism should not be left aside due to its association with the increase of bone mineral density, the protector effect against Alzheimer and other types of dementia, possibly due to its participation in the relationship between ¦¢-amyloid and the cholesterol levels.

[Incorporation of caffeine into the macromicete fungus Pleurotus sajor-caju growing on coffee pulp]. / Incorporación de cafeína en el hongo Pleurotus sajor-caju cultivado sobre pulpa de café

TWhen the chemical composition of secondary metabolites from the Pleurotus sajor-caju growing on coffee pulp were study, it was found that the fungus has the faculty of incorporating caffeine inside its fructiferous body. Component of the substrate (around 1.3% on dry basis) did not show a structural change over the alkaloid; this constitutes an unexpected outcome for a species belonging to realm of the fungi.

Incorporación de cafeína en el hongo Pleurotus sajor-caju cultivado sobre pulpa de café / Incorporation of caffeine into the macromicete fungus Pleurotus sajor-caju growning on coffee pulp

Al estudiar la composición química de los metabolitos secundarios dePleurotus sajor-caju cultivado en pulpa de café, se encontró que el hongotiene la capacidad de incorporar en su fructificación la cafeína, componentedel sustrato (cerca del 1,3% en base seca), sin modificar la estructura delalcaloide, lo que constituye un resultado que no es el esperado en lasespecies pertenecientes al reino de los hongos(AU)

When the chemical composition of secondary metabolites from the Pleurotussajor-caju growing on coffee pulp were study, it was found that the fungus hasthe faculty of incorporating caffeine inside its fructiferous body. Component ofthe substrate (around 1.3% on dry basis) did not show a structural changeover the alkaloid; this constitutes an unexpected outcome for a speciesbelonging to realm of the fungi(AU)